Микробын метапротеомик: дээж боловсруулах, мэдээлэл цуглуулахаас эхлээд өгөгдөлд дүн шинжилгээ хийх хүртэл

Ву Энхүй, Цяо Лян*

Шанхай хот, Фудан их сургуулийн химийн тэнхим 200433, Хятад

Бичил биетүүд хүний ​​өвчин, эрүүл мэндтэй нягт холбоотой байдаг. Микробын нэгдлүүдийн бүрэлдэхүүн, тэдгээрийн чиг үүргийг хэрхэн ойлгох вэ гэдэг нь яаралтай судлах шаардлагатай томоохон асуудал юм. Сүүлийн жилүүдэд метапротеомик нь бичил биетний бүтэц, үйл ажиллагааг судлах техникийн чухал хэрэгсэл болж байна. Гэсэн хэдий ч бичил биетний нийгэмлэгийн дээжийн нарийн төвөгтэй байдал, өндөр ялгаатай байдлаас шалтгаалан дээж боловсруулах, масс-спектрометрийн мэдээлэл цуглуулах, мэдээлэлд дүн шинжилгээ хийх нь метапротеомикийн өмнө тулгарч буй гурван гол асуудал болоод байна. Метапротеомикийн шинжилгээнд янз бүрийн төрлийн дээжийн урьдчилсан боловсруулалтыг оновчтой болгох, бичил биетнийг ялгах, баяжуулах, олборлох, задлах схемийг хэрэгжүүлэх шаардлагатай байдаг. Нэг зүйлийн протеомын нэгэн адил метапротеомикийн масс спектрометрийн өгөгдөл цуглуулах горимд өгөгдөлд хамааралтай олж авах (DDA) горим ба өгөгдөлд хамааралгүй олж авах (DIA) горимууд орно. DIA мэдээлэл цуглуулах горим нь дээжийн пептидийн мэдээллийг бүрэн цуглуулж чаддаг бөгөөд хөгжлийн асар их боломжтой. Гэсэн хэдий ч метапротеомын дээжийн нарийн төвөгтэй байдлаас шалтгаалан түүний DIA-ийн өгөгдлийн шинжилгээ нь метапротеомикийн гүн гүнзгий хамрах хүрээг саатуулж буй томоохон асуудал болжээ. Өгөгдлийн шинжилгээний хувьд хамгийн чухал алхам бол уургийн дарааллын мэдээллийн сан байгуулах явдал юм. Мэдээллийн сангийн хэмжээ, бүрэн байдал нь таних тоонд ихээхэн нөлөө үзүүлэхээс гадна төрөл зүйл, функциональ түвшинд дүн шинжилгээ хийхэд нөлөөлдөг. Одоогийн байдлаар метапротеомын мэдээллийн санг бий болгох алтан стандарт нь метагеном дээр суурилсан уургийн дарааллын мэдээллийн сан юм. Үүний зэрэгцээ давталттай хайлтад суурилсан олон нийтийн мэдээллийн санг шүүх арга нь практик ач холбогдолтой болох нь батлагдсан. Өгөгдлийн шинжилгээний тусгай стратегийн үүднээс авч үзвэл пептид төвтэй DIA мэдээллийн шинжилгээний аргууд нь туйлын үндсэн чиглэлийг эзэлдэг. Гүн гүнзгий суралцах, хиймэл оюун ухааныг хөгжүүлснээр энэ нь макропротеомик өгөгдлийн шинжилгээний нарийвчлал, хамрах хүрээ, шинжилгээний хурдыг ихээхэн нэмэгдүүлэх болно. Доод урсгалын биоинформатикийн шинжилгээний хувьд сүүлийн жилүүдэд бичил биетний бүлгүүдийн бүрэлдэхүүнийг гаргаж авахын тулд уураг, пептидийн түвшин, генийн түвшинд зүйлийн тэмдэглэгээ хийх боломжтой цуврал тэмдэглэгээний хэрэгслүүдийг боловсруулсан. Бусад омикийн аргуудтай харьцуулахад микробын бүлгүүдийн функциональ шинжилгээ нь макропротеомикийн өвөрмөц онцлог юм. Макропротеомик нь бичил биетний бүлгүүдийн олон омимик шинжилгээний чухал хэсэг болсон бөгөөд хамрах гүн, илрүүлэх мэдрэмж, өгөгдөлд дүн шинжилгээ хийх бүрэн чадавхи зэргээрээ маш их хөгжих боломжтой хэвээр байна.

01 Дээжийн урьдчилсан боловсруулалт

Одоогийн байдлаар метапротеомикийн технологийг хүний ​​микробиом, хөрс, хүнс, далай, идэвхтэй лаг болон бусад салбарт өргөнөөр ашиглаж байна. Нэг зүйлийн протеомын шинжилгээтэй харьцуулахад нарийн төвөгтэй дээжийн метапротеомын дээжийн урьдчилсан боловсруулалт нь илүү их бэрхшээлтэй тулгардаг. Бодит дээж дэх бичил биетний найрлага нь нарийн төвөгтэй, элбэг дэлбэг байдлын динамик хүрээ нь том, янз бүрийн төрлийн бичил биетний эсийн хананы бүтэц маш өөр бөгөөд дээж нь ихэвчлэн их хэмжээний эзэн уураг болон бусад хольц агуулдаг. Тиймээс метапротеомын шинжилгээ хийхдээ янз бүрийн төрлийн дээжийг оновчтой болгох, бичил биетний ялгах, баяжуулах, олборлох, задлах схемийг хэрэгжүүлэх шаардлагатай байдаг.

Төрөл бүрийн дээжээс бичил биетний метапротеомыг гаргаж авах нь тодорхой ижил төстэй, зарим ялгаатай талуудтай боловч одоогийн байдлаар метапротеомын янз бүрийн төрлийн дээжийг урьдчилан боловсруулах нэгдсэн процесс байхгүй байна.

02 Масс спектрометрийн мэдээлэл цуглуулах

Бууны протеомын шинжилгээнд урьдчилсан боловсруулалтын дараах пептидийн хольцыг эхлээд хроматографийн баганад салгаж, дараа нь иончлолын дараа мэдээлэл авах зорилгоор масс спектрометрт оруулна. Нэг зүйлийн протеомын шинжилгээтэй адил макропротеомын шинжилгээнд масс спектрометрийн өгөгдөл цуглуулах горимд DDA горим ба DIA горим орно.

Масс спектрометрийн багажуудыг тасралтгүй давтаж, шинэчлэхийн хэрээр өндөр мэдрэмжтэй, нарийвчлалтай масс спектрометрийн багажуудыг метапротеомд хэрэглэж, метапротеомын шинжилгээний хамрах хүрээг мөн тасралтгүй сайжруулж байна. Удаан хугацааны туршид Orbitrap тэргүүтэй өндөр нарийвчлалтай масс спектрометрийн цуврал хэрэгслийг метапротеомод өргөнөөр ашиглаж ирсэн.

Эх бичвэрийн 1-р хүснэгтэд 2011 оноос өнөөг хүртэлх метапротеомикийн талаархи зарим төлөөллийн судалгааг дээжийн төрөл, шинжилгээний стратеги, масс спектрометрийн хэрэгсэл, олж авах арга, шинжилгээний программ хангамж, таних тоогоор харуулав.

03 Масс спектрометрийн өгөгдлийн шинжилгээ

3.1 DDA мэдээллийн шинжилгээний стратеги

3.1.1 Өгөгдлийн сангийн хайлт

3.1.2de novoдарааллын стратеги

3.2 ШШГЕГ-ын мэдээллийн шинжилгээний стратеги

04Зүйлийн ангилал ба функциональ тайлбар

Төрөл бүрийн ангилал зүйн түвшний бичил биетний бүлгүүдийн бүрэлдэхүүн нь микробиомын судалгааны гол судалгааны чиглэлүүдийн нэг юм. Сүүлийн жилүүдэд бичил биетний бүлгүүдийн найрлагыг олж авахын тулд уураг, пептидийн түвшин, генийн түвшинд зүйлүүдийг тэмдэглэж авах хэд хэдэн тэмдэглэгээний хэрэгслийг боловсруулсан.

Функциональ тэмдэглэгээний мөн чанар нь зорилтот уургийн дарааллыг функциональ уургийн дарааллын мэдээллийн сантай харьцуулах явдал юм. GO, COG, KEGG, eggNOG гэх мэт генийн функцын мэдээллийн санг ашиглан макропротеомоор тодорхойлогдсон уураг дээр янз бүрийн функциональ тайлбарын шинжилгээ хийж болно. Тэмдэглэгээний хэрэгсэлд Blast2GO, DAVID, KOBAS гэх мэт орно.

05 Дүгнэлт ба хэтийн төлөв

Хүний эрүүл мэнд, өвчин эмгэгт бичил биетэн чухал үүрэг гүйцэтгэдэг. Сүүлийн жилүүдэд метапротеомик нь бичил биетний бүлгүүдийн үйл ажиллагааг судлах техникийн чухал хэрэгсэл болсон. Метапротеомикийн аналитик үйл явц нь нэг төрлийн протеомикийнхтэй төстэй боловч метапротеомикийн судалгааны объектын нарийн төвөгтэй байдлаас шалтгаалан дээжийн урьдчилсан боловсруулалт, мэдээлэл цуглуулахаас эхлээд өгөгдөлд дүн шинжилгээ хийх хүртэлх шинжилгээний үе шат бүрт тодорхой судалгааны стратеги баримтлах шаардлагатай байдаг. Одоогийн байдлаар урьдчилан боловсруулах аргуудыг сайжруулж, масс спектрометрийн технологийн тасралтгүй шинэчлэл, биоинформатикийн хурдацтай хөгжлийн ачаар метапротеомик нь таних гүн, хэрэглээний цар хүрээг хамарч байна.

Макропротеомын дээжийг урьдчилан боловсруулах явцад эхлээд дээжийн шинж чанарыг анхаарч үзэх хэрэгтэй. Бичил биетнийг хүрээлэн буй орчны эс, уурагаас хэрхэн ялгах вэ гэдэг нь макропротеомуудад тулгардаг гол сорилтуудын нэг бөгөөд салгах үр ашиг, бичил биетний алдагдлын хоорондын тэнцвэрт байдал нь шийдвэрлэх зайлшгүй шаардлагатай асуудал юм. Хоёрдугаарт, бичил биетний уургийн олборлолт нь янз бүрийн бактерийн бүтцийн гетероген байдлаас үүдэлтэй ялгааг харгалзан үзэх ёстой. Мөрийн хүрээн дэх макропротеомын дээжийг урьдчилан цэвэрлэх тусгай аргыг мөн шаарддаг.

Масс-спектрометрийн хэрэгслийн хувьд LTQ-Orbitrap, Q Exactive зэрэг Orbitrap масс анализатор дээр суурилсан масс спектрометрээс timsTOF Pro зэрэг ионы хөдөлгөөнт хосолсон нислэгийн массын анализаторт суурилсан масс спектрометр рүү шилжсэн. . Ионы хөдөлгөөнт хэмжээсийн мэдээлэл бүхий timsTOF цуврал хэрэгслүүд нь илрүүлэх өндөр нарийвчлал, илрүүлэх хязгаар бага, давтагдах чадвар сайтай. Эдгээр нь аажмаар нэг зүйлийн протеом, метапротеом, метаболом гэх мэт масс спектрометрийн илрүүлэлт шаарддаг төрөл бүрийн судалгааны салбарт чухал хэрэгсэл болсон. Удаан хугацааны туршид масс спектрометрийн багаж хэрэгслийн динамик хүрээ нь метапротеомын судалгааны уургийн хамрах хүрээг хязгаарлаж байсныг тэмдэглэх нь зүйтэй. Ирээдүйд илүү том динамик мужтай масс спектрометрийн хэрэгслүүд нь метапротеом дахь уургийг тодорхойлох мэдрэмж, нарийвчлалыг сайжруулж чадна.

Масс спектрометрийн өгөгдөл олж авахын тулд DIA мэдээлэл цуглуулах горимыг нэг зүйлийн протеомод өргөнөөр нэвтрүүлсэн ч одоогийн макропротеомын ихэнх шинжилгээнд DDA мэдээлэл цуглуулах горимыг ашигладаг хэвээр байна. DIA мэдээлэл цуглуулах горим нь дээжийн фрагмент ионы мэдээллийг бүрэн авах боломжтой бөгөөд DDA мэдээлэл цуглуулах горимтой харьцуулахад макропротеомын дээжийн пептидийн мэдээллийг бүрэн авах боломжтой. Гэсэн хэдий ч DIA-ийн өгөгдлийн нарийн төвөгтэй байдлаас шалтгаалан DIA-ийн макропротеомын өгөгдөлд дүн шинжилгээ хийхэд ихээхэн бэрхшээлтэй тулгарсаар байна. Хиймэл оюун ухаан, гүнзгий суралцах чадварыг хөгжүүлснээр DIA мэдээллийн шинжилгээний үнэн зөв, бүрэн гүйцэд байдлыг сайжруулна гэж найдаж байна.

Метапротеомикийн өгөгдлийн шинжилгээнд гол үе шатуудын нэг нь уургийн дарааллын мэдээллийн санг бий болгох явдал юм. Гэдэсний ургамал гэх мэт алдартай судалгааны чиглэлээр IGC, HMP зэрэг гэдэсний бичил биетний мэдээллийн санг ашиглаж болох бөгөөд таних сайн үр дүнд хүрсэн. Бусад ихэнх метапротеомикийн шинжилгээний хувьд хамгийн үр дүнтэй мэдээллийн бааз байгуулах стратеги нь метагеномын дарааллын өгөгдөл дээр үндэслэн дээжийн тусгай уургийн дарааллын мэдээллийн санг бий болгох явдал юм. Нарийн төвөгтэй, том динамик хүрээ бүхий бичил биетний нийгэмлэгийн дээжийн хувьд бага элбэг төрлийг тодорхойлохын тулд дарааллын гүнийг нэмэгдүүлэх шаардлагатай бөгөөд ингэснээр уургийн дарааллын мэдээллийн сангийн хамрах хүрээг сайжруулна. Өгөгдлийн дараалал байхгүй тохиолдолд олон нийтийн мэдээллийн санг оновчтой болгохын тулд давтагдах хайлтын аргыг ашиглаж болно. Гэсэн хэдий ч давталттай хайлт нь FDR чанарын хяналтанд нөлөөлж болзошгүй тул хайлтын үр дүнг сайтар шалгах хэрэгтэй. Нэмж дурдахад, уламжлалт FDR чанарын хяналтын загваруудыг метапротеомикийн шинжилгээнд ашиглах боломжийг судлах нь зүйтэй хэвээр байна. Хайлтын стратегийн хувьд эрлийз спектрийн номын сангийн стратеги нь DIA метапротеомикийн хамрах хүрээг сайжруулж чадна. Сүүлийн жилүүдэд гүнзгий суралцахад үндэслэсэн урьдчилан таамагласан спектрийн номын сан нь DIA протеомикийн чиглэлээр өндөр үзүүлэлттэй байгааг харуулж байна. Гэсэн хэдий ч метапротеомын өгөгдлийн сан нь ихэвчлэн олон сая уургийн оруулгуудыг агуулдаг бөгөөд энэ нь урьдчилан таамагласан спектрийн сангуудын үр дүнд ихээхэн хэмжээний тооцооллын нөөцийг зарцуулж, хайлтын том орон зайд хүргэдэг. Түүнчлэн, метапротеом дахь уургийн дарааллын хоорондох ижил төстэй байдал нь маш их ялгаатай тул спектрийн номын сангийн таамаглалын загварын нарийвчлалыг баталгаажуулахад хүндрэлтэй байдаг тул урьдчилан таамагласан спектрийн сангууд метапротеомикт өргөн хэрэглэгддэггүй. Нэмж дурдахад, дараалалтай төстэй уургийн метапротеомикийн шинжилгээнд ашиглахын тулд уургийн дүгнэлт, ангиллын тэмдэглэгээний шинэ стратеги боловсруулах шаардлагатай байна.

Дүгнэж хэлэхэд, шинээр гарч ирж буй микробиомын судалгааны технологийн хувьд метапротеомикийн технологи нь судалгааны томоохон үр дүнд хүрсэн бөгөөд хөгжлийн асар их нөөц бололцоотой юм.