Шингэн хроматографи нь түүхий эд, завсрын бүтээгдэхүүн, бэлдмэл, сав баглаа боодлын материалын бүрэлдэхүүн хэсэг бүрийн агууламж, хольцыг шалгах үндсэн арга боловч олон бодист найдах стандарт арга байхгүй тул шинэ арга боловсруулах зайлшгүй шаардлагатай. Шингэн фазын аргыг боловсруулахад хроматографийн багана нь шингэний хроматографийн гол цөм байдаг тул тохирох хроматографийн баганыг хэрхэн сонгох нь маш чухал юм. Энэ нийтлэлд зохиогч шингэний хроматографийн баганыг хэрхэн сонгох талаар гурван талаас нь тайлбарлах болно: ерөнхий санаа, анхаарах зүйлс, хэрэглээний хамрах хүрээ.
A. Шингэн хроматографийн баганыг сонгох ерөнхий санаа
1. Шинжлэх бодисын физик, химийн шинж чанарыг үнэлэх: химийн бүтэц, уусах чадвар, тогтвортой байдал (исэлдүүлэх/багасгах/гидролиз хийхэд хялбар эсэх гэх мэт), хүчиллэг, шүлтлэг зэрэг, ялангуяа химийн бүтэц нь гол зүйл юм. шинж чанарыг тодорхойлох хүчин зүйл, тухайлбал коньюгат бүлэг нь хэт ягаан туяаг хүчтэй шингээх, хүчтэй флюресценттэй байдаг;
2. Шинжилгээний зорилгыг тодорхойлох: өндөр тусгаарлалт, баганын үр ашиг өндөр, дүн шинжилгээ хийх хугацаа богино, өндөр мэдрэмж, өндөр даралтын эсэргүүцэл, баганын урт хугацаа, бага зардал гэх мэт шаардлагатай эсэх;
- Тохиромжтой хроматографийн баганыг сонгоно уу: хроматографийн дүүргэгчийн найрлага, физик, химийн шинж чанар, тухайлбал бөөмийн хэмжээ, нүх сүвний хэмжээ, температурын хүлцэл, рН-ийн хүлцэл, шинжлэгдэх бодисын шингээлт гэх мэтийг ойлгох.
- Шингэн хроматографийн баганыг сонгоход анхаарах зүйлс
Энэ бүлэгт хроматографийн баганын физик, химийн шинж чанарын үүднээс хроматографийн баганыг сонгохдоо анхаарах хүчин зүйлсийг авч үзэх болно. 2.1 Дүүргэгч матриц
2.1.1 Цахиурт гель матриц Ихэнх шингэн хроматографийн баганын дүүргэгч матриц нь цахиурлаг гель юм. Энэ төрлийн дүүргэгч нь өндөр цэвэршилттэй, хямд өртөгтэй, механик хүч чадал өндөртэй, бүлгийг өөрчлөхөд хялбар (фенил холбоо, амин холбоо, циано холбоо гэх мэт) боловч түүний тэсвэрлэх рН-ийн утга, температурын хязгаар хязгаарлагдмал: Ихэнх цахиур гель матриц дүүргэгчийн рН-ийн хүрээ 2-оос 8 байна, гэхдээ тусгайлан өөрчилсөн цахиур гельтэй холбогдсон фазын рН-ийн хүрээ нь 1.5-10 хүртэл өргөн байж болох ба бага рН-д тогтвортой, тусгайлан өөрчилсөн цахиур гельтэй холбогдсон фазууд бас байдаг. рН 1-ээс 8 хүртэл тогтвортой Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18 зэрэг; цахиурын гель матрицын дээд температурын хязгаар нь ихэвчлэн 60 ℃ байдаг ба зарим хроматографийн багана нь өндөр рН-д 40 ℃ температурыг тэсвэрлэдэг.
2.1.2 Полимер матриц Полимер дүүргэгч нь ихэвчлэн полистирол-дивинилбензол эсвэл полиметакрилат юм. Тэдний давуу тал нь рН-ийн өргөн хүрээг тэсвэрлэх чадвартай байдаг - тэдгээрийг 1-ээс 14-ийн мужид ашиглах боломжтой бөгөөд өндөр температурт (80 ° C-аас дээш) тэсвэртэй байдаг. Цахиурт суурилсан C18 дүүргэгчтэй харьцуулахад энэ төрлийн дүүргэгч нь илүү хүчтэй гидрофобик шинж чанартай бөгөөд макро сүвэрхэг полимер нь уураг зэрэг дээжийг салгахад маш үр дүнтэй байдаг. Үүний сул тал нь цахиурт суурилсан дүүргэгчтэй харьцуулахад баганын үр ашиг бага, механик бат бөх чанар сул байдаг. 2.2 Бөөмийн хэлбэр
Ихэнх орчин үеийн HPLC дүүргэгч нь бөмбөрцөг хэлбэртэй хэсгүүд боловч заримдаа жигд бус хэсгүүд байдаг. Бөмбөрцөг хэсгүүд нь баганын бага даралт, баганын өндөр үр ашиг, тогтвортой байдал, урт хугацааны амьдралыг хангах боломжтой; өндөр зуурамтгай чанар бүхий хөдөлгөөнт фазуудыг (фосфорын хүчил гэх мэт) ашиглах үед эсвэл дээжийн уусмал наалдамхай үед жигд бус хэсгүүд нь илүү том тодорхой гадаргуутай байдаг нь хоёр фазын бүрэн үйл ажиллагаанд илүү таатай байдаг бөгөөд үнэ нь харьцангуй бага байдаг. 2.3 Бөөмийн хэмжээ
Бөөмийн хэмжээ бага байх тусам баганын үр ашиг өндөр, тусгаарлалт их байх боловч өндөр даралтын эсэргүүцэл улам дорддог. Хамгийн түгээмэл хэрэглэгддэг багана нь 5 μм ширхэгийн хэмжээтэй багана юм; хэрэв тусгаарлах шаардлага өндөр байвал 1.5-3 μм дүүргэгчийг сонгох боломжтой бөгөөд энэ нь зарим нарийн төвөгтэй матриц болон олон бүрэлдэхүүн хэсэгтэй дээжийг салгах асуудлыг шийдвэрлэхэд тохиромжтой. UPLC нь 1.5 μм дүүргэгчийг ашиглах боломжтой; 10 μм ба түүнээс дээш ширхэгийн хэмжээтэй дүүргэгчийг ихэвчлэн хагас бэлдмэл эсвэл бэлдмэлийн баганад ашигладаг. 2.4 Нүүрстөрөгчийн агууламж
Нүүрстөрөгчийн агууламж нь силикагелийн гадаргуу дээрх наалдсан фазын эзлэх хувийг илэрхийлдэг бөгөөд энэ нь тодорхой гадаргуугийн талбай болон наалдсан фазын хамрах хүрээтэй холбоотой юм. Нүүрстөрөгчийн өндөр агууламж нь баганын өндөр багтаамж, өндөр нарийвчлалыг хангадаг бөгөөд ихэвчлэн өндөр тусгаарлалт шаарддаг нарийн төвөгтэй дээжүүдэд ашиглагддаг боловч хоёр фазын харилцан үйлчлэлийн хугацаа урт байдаг тул шинжилгээний хугацаа урт байдаг; Нүүрстөрөгчийн агууламж багатай хроматографийн баганууд нь шинжилгээний хугацаа богино бөгөөд өөр өөр сонгомол шинж чанартай байдаг бөгөөд ихэвчлэн хурдан шинжилгээ хийх шаардлагатай энгийн дээж болон усан фазын өндөр нөхцөл шаардсан дээжид ашиглагддаг. Ерөнхийдөө C18-ийн нүүрстөрөгчийн агууламж 7% -иас 19% хооронд хэлбэлздэг. 2.5 Нүхний хэмжээ ба тодорхой гадаргуугийн талбай
HPLC шингээх орчин нь сүвэрхэг хэсгүүд бөгөөд ихэнх харилцан үйлчлэл нь нүхэнд явагддаг. Тиймээс молекулууд шингэж, салгахын тулд нүхэнд орох ёстой.
Нүхний хэмжээ ба тодорхой гадаргуугийн талбай нь хоёр нэмэлт ойлголт юм. Нүхний жижиг хэмжээ гэдэг нь тодорхой гадаргуугийн том талбай гэсэн үг бөгөөд эсрэгээр. Их хэмжээний тодорхой гадаргуугийн талбай нь дээжийн молекулууд болон холбогдсон фазуудын хоорондын харилцан үйлчлэлийг нэмэгдүүлж, хадгалалтыг сайжруулж, дээжийн ачаалал, баганын багтаамжийг нэмэгдүүлж, нарийн төвөгтэй бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг салгаж болно. Бүрэн сүвэрхэг дүүргэгч нь энэ төрлийн дүүргэгчдэд хамаарна. Тусгаарлах өндөр шаардлага бүхий хүмүүсийн хувьд том гадаргуутай дүүргэгчийг сонгохыг зөвлөж байна; жижиг тодорхой гадаргуугийн талбай нь буцах даралтыг бууруулж, баганын үр ашгийг дээшлүүлж, градиент шинжилгээ хийхэд тохиромжтой тэнцвэрийн хугацааг багасгадаг. Үндсэн бүрхүүлийн дүүргэгч нь энэ төрлийн дүүргэгчдэд хамаарна. Тусгаарлалтын баталгааг хангах үүднээс анализын үр ашгийн өндөр шаардлага бүхий жижиг гадаргуутай дүүргэгчийг сонгохыг зөвлөж байна. 2.6 Нүх сүвний хэмжээ ба механик бат бэх
"Нүх сүвний эзэлхүүн" гэж нэрлэгддэг нүхний эзэлхүүн нь нэгж ширхэгт ногдох хоосон эзэлхүүний хэмжээг илэрхийлдэг. Энэ нь дүүргэгчийн механик хүчийг сайн тусгаж чаддаг. Нүх сүвний эзэлхүүн ихтэй дүүргэгчийн механик хүч чадал нь жижиг нүхтэй дүүргэгчээс арай сул байдаг. Нүх сүвний эзэлхүүн нь 1.5 мл/г-аас бага буюу тэнцүү хэмжээтэй дүүргэгчийг HPLC ялгахад ихэвчлэн ашигладаг бол 1.5 мл/г-аас их нүх сүвний эзэлхүүнтэй дүүргэгчийг молекул ялгах хроматографи болон нам даралтын хроматографид голчлон ашигладаг. 2.7 Хязгаарлалтын хувь хэмжээ
Хамгаалах нь нэгдлүүд болон ил гарсан силанолын бүлгүүдийн харилцан үйлчлэлийн улмаас үүссэн хаягдлын оргилуудыг (шүлтлэг нэгдлүүд ба силанолын бүлгүүдийн хоорондох ионы холбоо, ван дер Ваалсын хүч ба хүчиллэг нэгдлүүд ба силанолын бүлгүүдийн хоорондох устөрөгчийн холбоо гэх мэт) бууруулж, баганын үр ашиг, оргил хэлбэрийг сайжруулдаг. . Таглаагүй холбосон фазууд нь битүүмжилсэн фазуудтай, ялангуяа туйлын дээжийн хувьд өөр өөр сонгомол чанарыг бий болгоно.
- Янз бүрийн шингэн хроматографийн баганын хэрэглээний хамрах хүрээ
Энэ бүлэгт янз бүрийн төрлийн шингэн хроматографийн баганын хэрэглээний хамрах хүрээг зарим тохиолдолд тайлбарлах болно.
3.1 Урвуу фазын C18 хроматографийн багана
C18 багана нь хамгийн түгээмэл хэрэглэгддэг урвуу фазын багана бөгөөд ихэнх органик бодисын агууламж, хольцын сорилтыг хангаж чаддаг бөгөөд дунд туйлтай, сул туйлттай, туйлтгүй бодисуудад хамааралтай. C18 хроматографийн баганын төрөл, үзүүлэлтийг салгах тусгай шаардлагын дагуу сонгоно. Жишээлбэл, ялгах өндөр шаардлага бүхий бодисын хувьд 5 мкм * 4.6 мм * 250 мм-ийн үзүүлэлтүүдийг ихэвчлэн ашигладаг; нарийн төвөгтэй салгах матрицтай, ижил төстэй туйлшрал бүхий бодисын хувьд 4 мкм*4,6 мм*250 мм-ийн үзүүлэлт эсвэл жижиг ширхэгийн хэмжээг ашиглаж болно. Жишээлбэл, зохиолч 3 μm * 4.6 мм * 250 мм баганыг ашиглан селекоксиб API дахь генотоксик хоёр хольцыг илрүүлсэн. Хоёр бодисыг салгах нь 2.9 хүрэх боломжтой бөгөөд энэ нь маш сайн. Үүнээс гадна, салгах нөхцлийг хангах үүднээс хурдан шинжилгээ хийх шаардлагатай бол 10 мм эсвэл 15 мм-ийн богино баганыг ихэвчлэн сонгодог. Жишээлбэл, зохиогч пиперакуин фосфатын API дахь генотоксик хольцыг илрүүлэхийн тулд LC-MS/MS ашиглах үед 3 мкм*2,1 мм*100 мм багана ашигласан. Бохирдол ба үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн хоорондох ялгаа 2.0 байсан бөгөөд дээжийг 5 минутын дотор илрүүлэх боломжтой. 3.2 Урвуу фазын фенил багана
Фенил багана нь урвуу фазын баганын төрөл юм. Энэ төрлийн багана нь үнэрт нэгдлүүдийг сонгох чадвар сайтай байдаг. Хэрэв энгийн C18 баганаар хэмжсэн үнэрт нэгдлүүдийн хариу сул байвал фенил баганыг солих талаар бодож болно. Жишээлбэл, намайг celecoxib API хийж байх үед ижил үйлдвэрлэгчийн фенил баганаар хэмжсэн үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн хариу үйлдэл нь ижил үзүүлэлттэй (бүгд 5 мкм * 4.6 мм * 250 мм) C18 баганаас 7 дахин их байсан. 3.3 Хэвийн фазын багана
Урвуу фазын баганад үр дүнтэй нэмэлт болгон хэвийн фазын багана нь туйлшрал ихтэй нэгдлүүдэд тохиромжтой. Хэрэв урвуу фазын баганад 90%-иас дээш усан фазаар шүүрүүлэх үед оргил үе нь маш хурдан хэвээр байгаа бөгөөд уусгагчийн оргилд ойртож, давхцаж байвал та ердийн фазын баганыг солих талаар бодож болно. Энэ төрлийн багана нь хилик багана, амин багана, циано багана гэх мэтийг агуулдаг.
3.3.1 Хилик багана Хилик багана нь туйлын бодисуудад үзүүлэх хариу урвалыг сайжруулахын тулд ихэвчлэн гидрофиль бүлгүүдийг холбосон алкилийн гинжин хэлхээнд суулгадаг. Энэ төрлийн багана нь чихрийн бодисыг шинжлэхэд тохиромжтой. Зохиогч энэ төрлийн баганыг ксилоз болон түүний деривативын агуулга, холбогдох бодисыг хийхдээ ашигласан. Ксилозын деривативын изомеруудыг бас сайн салгаж болно;
3.3.2 Амин багана ба циано багана Амин багана ба циано багана нь тусгай бодисын сонгомол чанарыг сайжруулахын тулд нэгдмэл алкилийн гинжин хэлхээний төгсгөлд амин болон циано өөрчлөлтийг тус тус оруулахыг хэлнэ: жишээлбэл, амин багана нь сайн сонголт юм. элсэн чихэр, амин хүчил, суурь, амидыг ялгах зориулалттай; циано багана нь устөрөгчжүүлсэн болон устөрөгчгүй бүтэцтэй ижил төстэй бодисыг ялгахдаа илүү сайн сонгомол байдаг. Амин багана ба циано баганыг ердийн фазын багана болон урвуу фазын багана хооронд сольж болох боловч ойр ойрхон солихыг зөвлөдөггүй. 3.4 Хирал багана
Хирал багана нь нэрнээс нь харахад хиралын нэгдлүүдийг ялгах, шинжлэхэд тохиромжтой, ялангуяа эмийн салбарт. Уламжлалт урвуу фаз ба хэвийн фазын багана нь изомеруудыг салгаж чадахгүй үед ийм төрлийн баганыг авч үзэж болно. Жишээлбэл, зохиогч 1,2-дифенилэтилендиамин (1S, 2S)-1, 2-дифенилэтилендиамин ба (1R, 2R)-1, 2 гэсэн хоёр изомерыг салгахын тулд 5 мкм*4.6 мм*250 мм хэмжээтэй хираль баганыг ашигласан. -дифенилэтилендиамин ба хоёрын хоорондох салалт 2.0 орчимд хүрсэн. Гэсэн хэдий ч хирал багана нь бусад төрлийн баганаас илүү үнэтэй байдаг ба ихэвчлэн 1W+/piece. Хэрэв ийм багана шаардлагатай бол тухайн нэгж хангалттай төсөв гаргах шаардлагатай. 3.5 Ион солилцооны багана
Ион солилцооны багана нь ион, уураг, нуклейн хүчил, зарим чихрийн бодис зэрэг цэнэгтэй ионуудыг ялгах, шинжлэхэд тохиромжтой. Дүүргэгчийн төрлөөр тэдгээрийг катион солилцооны багана, анионы солилцооны багана, хүчтэй катион солилцооны багана гэж хуваана.
Катион солилцооны баганууд нь кальци, устөрөгчийн үндсэн дээр тулгуурласан багана агуулдаг бөгөөд эдгээр нь амин хүчил зэрэг катион бодисыг шинжлэхэд голчлон тохиромжтой байдаг. Жишээлбэл, зохиолч кальцийн глюконат ба кальцийн ацетатыг угаах уусмалд шинжлэхдээ кальци дээр суурилсан баганыг ашигласан. Хоёр бодис хоёулаа λ=210нм-д хүчтэй хариу үйлдэл үзүүлж, ялгах зэрэг нь 3.0 хүрсэн; Зохиогч глюкозтой холбоотой бодисыг шинжлэхдээ устөрөгч дээр суурилсан баганыг ашигласан. Холбогдох хэд хэдэн үндсэн бодисууд - мальтоз, мальтотриоз, фруктозууд нь дифференциал детекторын дор өндөр мэдрэмжтэй байсан бөгөөд илрүүлэх хязгаар нь 0.5 ppm, тусгаарлах зэрэг нь 2.0-2.5 байв.
Анион солилцооны багана нь органик хүчил, галоген ион зэрэг анион бодисыг шинжлэхэд голчлон тохиромжтой; катион солилцооны хүчтэй багана нь ион солилцооны хүчин чадал, сонгомол чанар өндөртэй бөгөөд нарийн төвөгтэй дээжийг салгах, шинжлэхэд тохиромжтой.
Дээрх зүйл бол зохиогчийн өөрийн туршлагатай хослуулсан хэд хэдэн нийтлэг шингэн хроматографийн баганын төрөл, хэрэглээний хүрээний танилцуулга юм. Том нүхтэй хроматографийн багана, жижиг нүхтэй хроматографийн багана, ойрын хроматографийн багана, олон горимын хроматографийн багана, хэт өндөр үзүүлэлттэй шингэн хроматографийн багана (UHPLC), хэт критик шингэний хроматографийн багана гэх мэт бодит хэрэглээнд хроматографийн багана байдаг. SFC) гэх мэт. Тэд өөр өөр салбарт чухал үүрэг гүйцэтгэдэг. Хроматографийн баганын тодорхой төрлийг дээжийн бүтэц, шинж чанар, ялгах шаардлага болон бусад зорилгын дагуу сонгоно.
Шуудангийн цаг: 2024 оны 6-р сарын 14-ний хооронд